有机会饱览了王府和皇家珍藏的丰富典籍，包括《本草品汇精要》。与此同时从宫廷中获得了当时有关民间的大量本草相关信息，并看到了许多平时难以见到的药物标本，开阔了眼界，丰富知识。
东璧堂，是李时珍从太医院还乡后创立的堂号，辞官返乡后坐堂行医，致力于对药物的考察研究，在此期间，以自己的字——东璧为堂号，创立了东璧堂。李时珍和大徒弟王广和来到湖口，见一群人正抬着棺材送葬，而棺材里直往外流血，李时珍上前一看，见流出的血不是淤血而是鲜血，于是赶忙拦住人群，让抬棺材的人停下来，众人听了，面面相觑，不敢相信。李时珍看出了大家的心思，反复劝说，终于使主人答应开棺。先是进行了一番按摩，然后又在其心窝处扎了一针，不一会儿，就见棺内的妇人轻轻哼了一声醒了，不久之后，这名妇女又顺利产下一个儿子，原来这名妇女是因难产而陷入假死。
李时珍还可以“活人断其死”的，有家药店老板的儿子大吃大喝后，纵身翻越柜台，请李时珍诊脉，李时珍告诉他，小兄弟，你活不了三个时辰了，请赶快回家去，众人都不信，那个药店老板的儿子更是大骂不止。果不其然，不到三个时辰，这个人便死掉了，原来是此人吃饭过饱，纵身一跳，肠子断了，内脏受损。
在数十年行医以及阅读古典医籍的过程中，发现古代本草书中存在着不少错误，决心重新编纂一部本草书籍，着手开始编写《本草纲目》，以《证类本草》为蓝本，参考了800多部书籍，其间，多次离家外出考察，足迹遍及湖广、江西、直隶许多名山大川，弄清了许多疑难问题。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状和生长的情况。过去的本草书，虽然作了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去，所以越解释越糊涂，而且矛盾百出，使人莫衷一是。例如药物远志，南北朝著名医药学家陶弘景说它是小草，像麻黄，但颜色青，开白花，宋代马志却认为它像大青，并责备陶弘景根本不认识远志。又如狗脊一药，有的说它像萆薢，有的说它像拔葜，有的又说它像贯众，说法很不一致。在他父亲的启示下，李时珍认识到，“读万卷书”固然需要，但“行万里路”更不可少。于是，他既“搜罗百氏”，又“采访四方”，深入实际进行调查。
经过27年的长期努力，完成《本草纲目》初稿，时年61岁，以后又经过10年三次修改，前后共计40年，直到去世