其调至甘肃，世宗不同意，将贾启与周尚文的俸禄一并夺去，巡按张光祖称二人一定不能共处，世宗这才将周尚文革职，并将贾启贬官。
吉囊扰固原，刘天和当时已担任三边总督，召周尚文前来，激其立功。适逢陕西总兵官魏时与吉囊于黑水苑交锋，周尚文尽出精锐，与魏时两面夹击，大败鞑靼军。此役，吉囊幼子十王阵亡，明军共斩首一百三十余级，不久，升周尚文为都督同知。
周尚文被推荐为东官厅听征总兵官兼后军都督府佥事，当时严嵩为礼部尚书，其子严世蕃也在后军都督府供职，骄横无常，周尚文当面叱责他，并将上疏弹劾，经严嵩道歉才作罢。严嵩将严世蕃调至别部，以避开周尚文，严氏父子自此对他恨之入骨，百般寻衅。周尚文以总兵官职镇守大同，到任后请求增加军饷及马匹，兵部认为周尚文所请过多，他正受诏书责备时，又与巡抚赵锦不和，周尚文便一再要求告老，朝廷不许，二人每日都互相诋毁。御史王三聘请求将周尚文调离大同，而朝廷以“大同敌冲，尚文假此避，不宜堕其奸谋”为由，反将赵锦调为甘肃巡抚。
吉囊之子俺答，率数万骑兵犯前卫，周尚文与之激战于黑山，杀吉囊子满汗歹，追至凉城，击退了鞑靼，斩获颇多，周尚文晋升为右都督。不久后，鞑靼又由宣府逼近北京近郊，出大同塞往北行军，周尚文率军邀击，稍有俘获。后来，鞑靼又大举入侵，进犯鹁鸽谷，将要南下，周尚文率军守备阳和，派多队骑兵骚扰鞑靼，鞑靼退兵后，世宗降敕奖赏周尚文。
当时，总督翁万达与周尚文商议修筑长城，自宣府西阳和至大同开山口，长约二百多里，由周尚文带领士卒完成。周尚文又增加了阳和以西至山西丫角口段，共四百余里，修筑敌台一千多座，开垦屯田四万余顷，增添守兵一万三千多人。世宗嘉奖他的功劳，升其为左都督，加太子太保，荫子世袭锦衣千户，史称“终明之世，总兵官加三公者，尚文一人而已”。
周尚文奏称陕西巡抚贾启挟怨报复，当年曾劾奏他的三个儿子冒功升赏，仍唆使陕西按察司前来治罪，俱发戍边，周尚文设问：“父子暌离异域，一旦遇警，臣以孤身当虏，谁为援者？”兵部指出其子因他事谪戍，实在与贾启无关，世宗旨意中也同意功过应该分开。世宗批令周尚文之子照原罪发遣，但实际谪戍的仅有其二子周君佑，长子周君佐及三子周君仁仍留在周尚文身边。
俺答犯大同、宣府，指挥顾相以千余骑迎敌，中伏，被围于弥陀山茨林墩，周尚文闻警，督参将吕勇、游击李梅