见之明，再度起用杨继盛，调为山东诸城县令，改任南京户部主事、刑部员外郎。当时，严嵩当权，恨仇鸾侵犯自己，心中高兴杨继盛首攻仇鸾，想骤然使杨继盛显贵，又将杨继盛改为兵部武选司员外郎。但杨继盛憎恶严嵩超过仇鸾，而且想起被谪籍后，一年内连迁四职，便考虑如何报效国家，唐顺之曾劝说他：“愿益留意，不朽之业，终当在执事而为。”年末，杨继盛在其妻张氏的启发下，决心弹劾严嵩。
杨继盛在斋戒三日后上《请诛贼臣疏》弹劾严嵩，历数其“五奸十大罪”，奏疏呈入后，朱厚熜已发怒，严嵩看见其中有召问二王的话，高兴地说可以指此为罪，便暗中向朱厚熜进谗。朱厚熜更加愤怒，将杨继盛下诏狱，诘问为什么要牵引二王，杨继盛辩解说：“不是二王谁不慑怕严嵩呢？”他在诏狱被廷杖一百，廷杖前，友人王西石托人送给杨继盛一副蛇胆，告诉他：“用此物可以止痛。”杨继盛收入袖中。一位苗姓校尉也送酒一壶，劝他：“可以此吃蚺蛇胆。”但杨继盛拒绝，曰：“椒山自有胆，何必蚺蛇哉！”苗姓校尉又说：“不要怕。”杨继盛回答：“岂有怕打杨椒山者。”于是谈笑赴堂受打。
杖刑完毕后，杨继盛被关入刑部狱，家人所送的药物都被巡风官李天荣所截下，杨继盛“两腿肿粗，相摩若一，不能前后；肿硬若木，不能屈伸。止手扶两人，用力努挣，足不覆地而行入狱”。提牢刘槚又将杨继盛转至条件更差的民监，幸得狱内外诸多人相助，才得以渡过难关。在狱中，杨继盛创伤发作，于半夜苏醒过来，摔碎瓷碗，用手拿碎片割腐肉，肉被割尽，筋挂膜，他又用手截去。为他持灯的狱卒颤抖欲坠，杨继盛却意气自如，在朝审时，观看杨继盛的人堵塞了道路，都非常叹息，甚至为他哭泣。
朱厚熜将杨继盛关入诏狱后，让刑部定罪，刑部侍郎王学益为严嵩党羽，他受严嵩的嘱咐，想以诈传亲王令旨的罪名将杨继盛绞死，郎中史朝宾坚持不同意。严嵩愤怒，将他贬出朝廷，刑部尚书何鳌最终妥协，像严嵩所指的那样定案，但世宗还不想杀杨继盛。严嵩本想将杨继盛杀死，但杨继盛在陆炳等人的保护下，在监狱之中存活三年之久。
杨继盛的好友王世贞等人为他四处奔走求救，严嵩见舆论不容，本想上疏解救杨继盛，但在其党羽鄢懋卿及其子严世蕃等人的说服之下，决心杀死杨继盛。当时，国子司业王材也在坐，争道：“继盛之死不足惜也，然关系国家甚大，老先生还当为天下后世虑。”但严嵩已决意杀杨继盛。适逢严嵩的党羽赵文华，送来对闽浙